| رساله دکترای رشته پزشکی با عنوان تولید، خالص‌سازی، تعیین ساختمان و بررسی اثرات سمیت سلولی پیگمان تولید شده توسط سویه سراشیا مارسه‌سنس PTCC 1111
سراشیا مارسه سنس یك باسیل گرم منفی از خانواده بزرگ انتروباكتریاسه می‌باشد، كه با توجه به تولید سه آنزیم خاص شامل DNAase، Lipase و gelatinase از سایر گونه‌ها تشخیص داده می‌شود
|
 |
| دسته بندی | پزشکی |
| فرمت فایل | doc |
| حجم فایل | 7528 کیلو بایت |
| تعداد صفحات فایل | 141 |
رساله دکترای رشته پزشکی با عنوان تولید، خالص‌سازی، تعیین ساختمان و بررسی اثرات سمیت سلولی پیگمان تولید شده توسط سویه سراشیا مارسه‌سنس PTCC 1111
خلاصه فارسی :
سراشیا مارسه سنس یك باسیل گرم منفی از خانواده بزرگ انتروباكتریاسه می‌باشد، كه با توجه به تولید سه آنزیم خاص شامل DNAase، Lipase و gelatinase از سایر گونه‌ها تشخیص داده می‌شود. ویژگی دیگر این باكتری تولید یك پیگمان قرمز رنگ درون سلولی به نام prodigiosin می‌باشد. این پیگمان به دلیل داشتن اثرات ضدقارچی، ضد باكتریایی و ضد پروتوزوآیی به عنوان یك داروی پر آتیه مطرح می‌باشد. امروزه انواع بدخیمی‌ها و سرطان‌ها از علل شایع مرگ و میر در سراسر دنیا می‌باشند كه درمان آنها نیز تا به حال موفقیت آمیز نبوده است. یكی از مشكلات علم پزشكی شكست دارو درمانی در درمان سرطان است، این شكست می‌تواند به دلیل عدم تحمل دارو از طرف بیمار، عوارض شیمی درمانی و یا بروز مقاومت دارویی باشد.
بر این اساس و همچنین به علت پیامدهای اجتماعی سرطان، جامعه پزشكی امروزه به دنبال شناسایی تارگت‌های جدید و تركیباتی با سمیت كمتر و اثر بخشی بیشتر نسبت به عوامل شیمی درمانی كه در حال حاضر استفاده می‌شود می‌باشند و از آنجایی كه با استفاده از میكروارگانیسم‌ها می‌توان به داروهای ضد سرطان با اثرات اختصاصی‌تر و سمیت كمتر برای انسان دست یافت كه روشهای تولید آنها نیز مقرون به صرفه می‌باشد، لذا هدف از این پایان نامه تولید، خالص‌سازی، تعیین ساختمان و بررسی اثرات سمیت سلولی پیگمان تولید شده توسط سویه سراشیا مارسه‌سنس PTCC 1111 می‌باشد.
به منظور تولید پیگمان، باكتری در محیط نوترینت براث كشت داده شد و به مدت 5 روز در دمای 28، گرمخانه گذاری گردید. سپس محیط كشت سانتریفوژ شد و پیگمان با استفاده از اتانول اسیدی از داخل سلول‌ها استخراج گردید. به منظور خالص‌سازی پیگمان از كروماتوگرافی ستونی استفاده شد. با استفاده از طیف و LC/MS مشخص شد كه این پیگمان یك تركیب تری پیرولی با اسكلت pyrrolypyrromethen و یك گروه متوكسی در موقعیت 4 و وزن مولكولی Da 323 می‌باشد.آزمایشات سمیت سلولی بر روی دو رده سلولی HT29 و T47D با استفاده از آزمون MTT انجام شد و مشخص شد كه Prodigiosin بر روی هر دو رده سلولی HT29 و T47D اثر مهار كنندگی رشد قابل قبولی داشته كه این اثر مهاركنندگی، اثری وابسته به غلظت و زمان بوده و با افزایش غلظت و مدت زمان مجاورت، این اثر افزایش می‌یابد. لازم به ذكر است كه اثر مهار كنندگی رشد prodigiosin بر روی سلولهای HT29 به طور مشهودی بیشتر از سلولهای T47D بوده است. با توجه به نتایج به دست آمده چنین به نظر می‌رسد كه prodigiosin این پتانسیل را دارد كه برای طراحی داروهای ضد سرطان جدید مورد مطالعه قرار گیرد.
کلمات کلیدی:
پیگمان
سرطان
prodigiosin
سمیت سلولی
محیط نوترینت براث
كروماتوگرافی ستونی
سویه سراشیا مارسه‌سنس PTCC 1111
1-1- اهمیت مسأله
بیماری سرطان یکی از معضلات اصلی طب کنونی و از علل عمده مرگ و میر در جهان است. لذا با توجه به گسترش انواع سرطان ها در جوامع بشری امروزی، شناسایی تارگت های جدید و طراحی و توسعه عوامل شیمی درمانی اختصاصی تر دو هدف بسیار مهم در تحقیقات به منظور یافتن داروهای ضد سرطان با اثر بخشی بیشتر و سمیت کمتر می باشد.یک خانواده از پیگمان های قرمز رنگ توسط گروهی از باکتری ها از جمله سراشیا مارسه سنس تولید می شود که اخیراً اثرات بیولوژیکی مختلفی مانند اثرات ضد باکتریایی، ضد قارچی، ضد پروتوزوآیی و سمیت سلولی بر روی برخی از رده های سلول های سرطانی مانند سرطان کولون، پستان ،ریه و ... برای آنها گزارش شده است (1).
تحقیقات انجام شده حاکی از آن است که این پیگمان ها باعث افزایش مرگ سلولی به صورت اختصاصی (آپاپتوز) در سلول های سرطانی می شوند، در حالی که هیچ گونه سمیت بارزی روی سلول های غیر بدخیم ندارند. با توجه به خصوصیات ضد سرطانی این خانواده انستیتو ملی سرطان (NCI) هم اثرات سایتوتوکسیک ترکیبات طبیعی این خانواده را تایید کرده است(2).از آنجایی که با استفاده از میکروارگانیسم ها می توان به داروهای ضد سرطانی با اثرات اختصاصی تر و سمیت کمتر برای انسان دست یافت که روش های تولید آنها نیز مقرون به صرفه می باشد لذا تولید، خالص سازی و تعیین ساختمان پیگمان تولید شده توسط سویه سراشیا مارسه- سنس1111 PTCCکه بومی ایران می باشد و بررسی اثرات سمیت سلولی آن بر روی برخی رده های سلول های سرطانی به منظور توسعه داروهایی با پتانسیل بالای درمان سرطان از اهمیت و ضرورت خاصی برخوردار می باشد.
فهرست مطالب
خلاصه فارسی3
فصل اول6
کلیات6
فصل اول : کلیات6
1-1- اهمیت مسأله6
1-2- بیان مسأله9
1-3- اهمیت موضوع11
فصل دوم:بررسی متون و مطالعات دیگران در این زمینه13
2-1- با سیل های گرم منفی روده ای (انتروباکتریاسه)13
2-1-2- طبقه بندی14
2-1-3- اهمیت انتروباکتریاسه15
2-1-4- مورفولوژی و شناسایی16
2-1-5- صفات کشت16
2-1-6- صفات بیوشیمیایی18
جدول 2-1 صفات بیوشیمیایی در جنس های مهم از خانواده انتروباکتریاسه18
2-1-7- ساختمان آنتی ژنی19
شکل 2-1 – اجزای آنتی ژنی در انتروباکتریاسه19
2-1-8- کلی سین ها (باکتریوسین ها)19
2-1-9- بیماری های ایجاد شده توسط انتروباکتریاسه هایی غیر از سالمونلا و شیگلا20
2-2- سراشیا مارسه سنس(Serratia marcescens)21
2-2-1- خصوصیات ظاهری21
شکل 2-2- باسیل های گرم منفی سراشیا مارسه سنس24
شکل 2-3- تصویر میکروسکوپ الکترونی سراشیا مارسه سنس24
2-2- 3- خصوصیات کشت24
شکل 2-4- تولید پیگمان قرمز رنگ توسط سراشیا مارسه سنس در محیط کشت آگاردار25
2-2-4- خواص بیوشیمیایی25
2-2-6- بیوسنتز پیگمان توسط سراشیا مارسه سنس26
2-3- عوامل موثر بر تولید پیگمان توسط سراشیامارسه سنس31
2-3-1- دما32
2-3-2- شرایط روشنایی :33
2-3-3- حضور آنتی بیوتیک ها34
2-3-4-2- منبع کربن35
نمودار 2-3- تجمع پیگمان توسط سراشیامارسه سنس در محیط حاوی : گلیسیرول (-) و استات (●)36
2-3-4-3- فسفات معدنی38
2-3-5- فعالیت تنفسی39
2-4- خصوصیات پیگمان تولید شده توسط سراشیا مارسه سنس39
2-5- سرطان42
2-5-2- تعریف سرطان43
2-5-3- نامگذاری سرطان44
2-5-4- چرخه سلولی44
2-5-5- علل سرطان47
2-5-6- روش های درمان سرطان47
2-5-6-1- شیمی درمانی47
2-5-6-1-1- داروهای ضد سرطان (آنتی نئوپلاستیک)48
2-5-7- مقاومت در برابر داروهای سایتوتوکسیک49
2-5-8- روش های غربال کردن داروهای ضد سرطانی50
2-6- کلیات کشت سلول52
2-6-1- مزایا و معایب کشت سلولی52
2-6-2- آزمایش های بررسی رشد و سمیت سلولی53
2-6-2-1- احیای رنگ های تترازولیوم55
2-6-2-2 آزمون MTT55
2-6-2-3- Trypan blue exclusion test60
2-6-3- تجهیزات آزمایشگاه کشت سلولی61
فصل سوم : مواد و روش‌ها65
3-1- دستگاه‌ها و مواد مورد نیاز جهت تولید، استخراج، خالص‌سازی و تعیین ساختمان پیگمان65
3-1-1- دستگاه‌ها65
3-1-2- مواد و محیط های كشت66
3-1-2-1- مواد شیمیایی66
3-1-2-2- محیط‌های كشت67
3-1-3- میكروارگانیسم67
3-2-1- كشت و فعال‌سازی باكتری67
3-2-2- كشت باكتری در محیط كشت نوترینت براث و گرمخانه‌گذاری در شرایط مناسب جهت تولید پیگمان68
3-2-3- جداسازی سلولهای باكتری از محیط كشت و استخراج پیگمان با استفاده از حلال آلی68
3-2-3-1- روش قلیایی جهت استخراج پیگمان68
3-2-3-2- روش اسیدی جهت استخراج پیگمان69
3-2-4- بررسی خلوص پیگمان استخراج شده به كمك كروماتوگرافی لایه نازك (TLC)70
3-2-4-1- سیستم حلال مناسب جهت TLC70
3-2-4-2- ظاهر كردن و مشاهده لكه‌ها71
3-2-5- خالص‌سازی پیگمان استخراج شده از سلولهای باكتری71
3-2-5-1- جداسازی فازها با استفاده از قیف دکانتور71
3-2-6- بررسی خلوص پیگمان خارج شده از ستون74
3-2-7- تعیین ساختمان پیگمان خالص شده با روشهای دستگاهی74
3-2-7-1- طیف سنجی مرئی و ماوراء بنفش75
Resonance(NMR) Nuclear Magnetic76
3-3- وسایل، مواد و دستگاه‌های مورد نیاز جهت انجام آزمایشات كشت سلولی79
3-4- آماده‌سازی محلول‌ها جهت كشت سلولی82
3-4-1- آماده‌سازی محیط كشت82
جدول 3-1 : اجزای محیط كشت RPMI-164084
3-4-2- آماده سازی سرم جنین گاوی (FBS)85
جدول 3-2 : اجزاء اصلی سرم (FBS)86
جدول 3-3 : دیگر اجزاء ضروری سرم برای حیات و رشد سلولی در محیط خارج از بدن (60)87
3-4-3- آماده سازی محلول‌های پنی سیلین G و استرپتومایسین87
3-4-4- آماده‌سازی بافر PBS88
3-4-5- آماده‌سازی رنگ تریپان بلو89
3-4-6- آماده سازی محلول x1 تریپسین- EDTA89
3-4-7- آماده‌سازی محلول MTT90
3-4-8- آماده سازی رقت‌های دوكسوروبیسین90
3-4-9- آماده‌سازی رقت‌های مختلف از نمونه پیگمان تخلیص شده90
3-6- تعویض محیط كشت92
3-7- پاساژ سلولی93
3-8-1- توضیحاتی در مورد تانك ازت98
3-9- شمارش مستقیم سلول‌ها به روش Trypan Blue Dye Exclusion98
3-11- آزمایشات انجام شده103
3-11-1- بررسی اثر غلظت‌های مختلف prodigiosin در مقایسه با دوكسوروبیسین بر رشد سلولهای HT 29 در مدت 2، 3 و 4 روز مجاورت103
3-11-2- بررسی اثر غلظت‌های مختلف prodigiosin در مقایسه با دوكسوروبیسین بر رشد سلول های T47D در مدت 2، 3 و 4 روز مجاورت105
فصل چهارم : نتایج106
4-1- تعیین ساختمان پیگمان خالص شده106
4-1-1- طیف جذبی مرئی و ماوراء بنفش prodigiosin106
شكل 4-2- ساختار prodigiosin109
4-1-3- طیف LC/MS/MS ، prodigiosin109
شكل 4-3- شكست های مولكول prodigiosin110
4-2- نتایج كشت سلولی110
4-2-1- بررسی اثر غلظت‌های مختلف prodigiosin در مقایسه با دوكسوروبیسین بر رشد سلولهای HT29 در مدت 2، 3 و 4 روز مجاورت111
نمودار 4-1- اثر غلظت های مختلف Prodigrosin در مقایسه با دوکسوروبیسین بر رشد سلول های HT29 در مدت 2، 3 و 4 روز مجاورت112
نمودار 4-2- اثر غلظت های مختلف Prodigrosin در مقایسه با دوکسوروبیسین بر رشد سلول های T47D در مدت 2، 3 و 4 روز مجاورت114
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری116
Abstract124
منابع:125
ضمایم133
دانلود طرح توجیهی پوشال کولر