| بررسی تنوع ژنتیکی انواع سیب با استفاده از مارکر SSR
هدف از این پایان نامه بررسی تنوع ژنتیکی انواع سیب با استفاده از مارکر SSR می باشد
|
 |
| دسته بندی | علوم کشاورزی و منابع طبیعی |
| فرمت فایل | doc |
| حجم فایل | 5770 کیلو بایت |
| تعداد صفحات فایل | 92 |
دانلود پایان نامه کارشناسی ارشد رشته کشاورزی
بررسی تنوع ژنتیکی انواع سیب با استفاده از مارکر SSR
چکیده:
ثبت و شناسایی ارقام و پایه های گیاهی و تعیین رابطه ژنتیکی بین آنها مستلزم دسترسی به روشهای دقیق و قابل تکراری که از شرایط محیطی متأثر نباشد، می باشد. روشهای سنتی تعیین هویت بر اساس مشاهده ظاهری درخت و میوه است. با توجه به اینکه بسیاری از خصوصیات ظاهری تحت تأثیر عوامل محیطی قرار می گیرند، این روش قابل اعتماد نیست.با استفاده از نشانگرها در سطح ملکول DNA می توان اطلاعات دقیقی از ژنوم گیاهان بدست آورد.از جمله نشانگرهای معتبر در بررسی ژنوم سیب، نشانگر SSR است که بدلیل تکرارپذیری بالا، ایجاد الگوی باندی نسبتاً ساده و توارث همبارز در بررسی تنوع ژنتیکی و شناسه دار کردن ارقام و پایه های سیب کارایی بالایی دارد.
در بررسی حاضر از 5 جفت نشانگر پلی مورفیک SSR بر روی 24 رقم و پایه سیب بمنظور تهیه شناسنامه ژنتیکی برای بعضی از ارقام و پایه ها و همچنین تعیین رابطه ژنتیکی بین آنها استفاده شد. نمونه های برگی از کلکسیون سیب جمع آوری و DNA آنها استخراج شدند و سپس با استفاده از نشانگرهای اختصاصی SSR مورد تکثیر قرار گرفتند. پس از الکتروفورز عمودی در دستگاه توالی یاب DNA در ژل پلی آکریل آمید و رنگ آمیزی نیترات نقره در مجموع 52 آلل پلی مورفیک در 5 لوکوس ریزماهوار ( میانگین 4/10 در هر لوکوس) شناسایی شدند.
تجزیه کلاستر بطور جداگانه برای ارقام و پایه ها بر اساس حضور و عدم حضور باند با استفاده از برنامه NTSYS و ضریب تشابه Dice مبتنی بر UPGMA انجام گرفت. دندوگرام حاصل از ارقام نشان داد که ارقام مورد بررسی تنوع زیادی داشتند و در 6 کلاستر جای گرفتند و سیبهای گلاب مورد بررسی توسط این 5 جفت نشانگر از هم تفکیک شدند. در دندوگرام پایه ها شباهت دو پایه MM111و MM106 مشاهده گردید.با استفاده از 3 آغازگر (CH01H01,02B1,CH02B10) باندهای اختصاصی در ارقام (24 رقم) مشاهده شد. همچنین اگوی نواربندی اختصاصی برای بعضی از ارقام در هر آغازگر بدست آمد. در نهایت این 5 آغازگر توانستند آللهای اختصاصی مربوط به پایه ها را تعیین کنند.
کلمات کلیدی:
مارکر SSR
شناسایی مولکولی
ارقام و پایه های سیب
مقدمه
مهمترین درختان میوه ای که در مناطق معتدله و سردسیری به صورت اهلی درآمده‌اند در خانواده گلسرخیان قرار دارند مانند سیب، گلابی، آلوچه، گیلاس و..... . سیب از نظر اقتصادی بیشترین اهمیت را در بین محصولات درختی مناطق معتدله و سردسیری دارد و تعداد زیادی از ارقام تجاری آن به دلیل گرده‌افشانی باز، تلاقی‌های كنترل شده و یا تلقیح موتاسیون سوماتیكی با ارقام سازگار، قابل استفاده در برنامه‌های اصلاحی اند. یك مشكل قابل توجه در صنعت سیب و فراورده های آن تعیین هویت ارقام آن می‌باشد. روشهای سنتی تعیین هویت بر اساس مشاهده ظاهری درخت ومیوه است. با توجه به اینكه بسیاری از خصوصیات ظاهری تحت تأثیر عوامل محیطی قرار می گیرند، این روش، قابل اعتماد نیست. روش دیگر برای تعیین هویت ارقام استفاده از نشانگر می باشد. استفاده از نشانگرها در سطح مولكول DNA دقیق ترین روش بررسی است که جزئیات بیشتری از ژنوم ارقام سیب را ارائه می‌دهد. ازجمله نشانگرهای معتبردر بررسی ژنوم سیب، نشانگر SSRاست که به دلیل قابلیت تکرارپذیری بالا، ایجاد الگوی باندی نسبتاً ساده و توارث هم بارز، در بررسی تنوع ژنتیکی و شناسه دار کردن ارقام سیب کارایی بالایی دارد. در این تحقیق با استفاده از نشانگرهای منتخب SSR تنوع ژنتیکی 29 رقم و پایه سیب و امکان دستیابی به نوارهای اختصاصی DNA در هر یک از ارقام و پایه ها مورد بررسی قرار گرفت.
فهرست مطالب
چکیده:1
مقدمه2
فصل اول:بررسی منابع و کلیات3
1-1- تاریخچه و گسترش سیب در جهان4
2-1- درخت سیب و خواص بتانیكی آن5
3-1- فرآورده‌های سیب6
4-1- خواص دارویی سیب6
5-1- ارزش غذایی سیب7
6-1- پایه‌های سیب8
1-6-1-پایه‌های بذری8
2-6-1- پایه‌های رویشی(غیر بذری)9
1-2-6-1-پایه‌های مالینگ9
2-2-6-1- پایه های مالینگ مرتون10
3-2-6-1-پایه های بوداگوسکی11
7-1- زیست شناسی مولكولی11
1-7-1- نشانگر11
2-7-1- هدف از كاربرد نشانگر11
3-7-1- انواع نشانگرهای ژنتیكی12
1-3-7-1- نشانگرهای ریخت‌شناسی (مورفولوژیكی)12
2-3-7-1- نشانگرهای سیتوژنتیكی12
3-3-7-1- نشانگرهای ملکولی در سطح پروتئین12
4-3-7-1- نشانگرهای مولكولی در سطح DNA13
5-3-7-1- انواع نشانگرهای DNA14
الف) نشانگرهای DNA غیر مبتنی بر PCR
- تفاوت طول قطعات حاصل از هضم (RFLP) 14
- تعداد متفاوت ردیف‌های تكراری و ماهوارك‌ها (VNTR & Minisatellites) 15
- پویش ژنومی نشانه‌های هضم (RLGS) 15
ب) نشانگرهای DNA مبتنی بر PCR15
4-7-1- ردیف‌های تكراری17
1-4-7-1- ماهواره‌ها18
2-4-7-1- ماهوارك‌ها18
3-4-7-1- ریز ماهواره‌ها (میكروستلایت‌ها یا SSR)19
5-7-1- چگونگی ایجاد میكروستلایت‌ها20
6-7-1- خصوصیات نشانگرهای SSR20
7-7-1- كاربردهای نشانگرهای SSR21
8-7-1- مزایای ریز ماهواره ها21
9-7-1- معایب ریز ماهواره‌ها22
10-7-1- اساس چند شكلی در جایگاههای ریزماهواره23
1-10-7-1- مدل کراسینگ اور نا متقارن (UCO) 23
2-10-7-1- مدل سر خوردن پلیمراز هنگام همانند سازی(SSM)24
8-1- واكنش زنجیره ای پلیمراز24
1-8-1- اجزای واکنش PCR24
1-1-8-1- آنزیم24
2-1-8-1-مخلوط ذروكسی نوكلئوتید تری فسفات ( dNTPs )25
3-1-8-1- DNA الگو25
4-1-8-1- آغازگرها25
5-1-8-1- بافرها و كلرید منیزیوم26
2-8-1- عوامل مؤثر براختصاصی بودن واكنش PCR26
1-2-8-1- غلظت مخلوط PCR26
2-2-8-1- دما27
3-2-8-1- تعداد و طول سیكل27
4-2-8-1- افزاینده های PCR27
3-8-1- (TD-PCR) Touch Down PCR27
4-8-1- PCR آشیانه ای28
9-1- الكتروفورز ژل آگارز28
10-1- الكترفورز ژل پلی آكریل آمید29
11-1- مروری بر تحقیقات انجام شده توسط نشانگر SSR29
فصل دوممواد و روشها31
1-2- مواد گیاهی32
2-2- استخراج DNA36
1-2-2- استخراجDNA به روش دلاپورتا36
2-2-2- استخراج DNA به روش CTAB37
3-2- تعیین کیفیت نمونه های DNA38
4-2- تعیین کمیت نمونه های DNA39
5-2- PCR39
1-5-2- اجزای واکنش زنجیره‌ای پلیمراز39
1-1-5-2- آغازگرها39
2-1-5-2- آنزیم Taq DNA polymerase40
3-1-5-2- بافر PCR41
4-1-5-2- کلرید منیزیوم41
5-1-5-2- dNTP41
2-5-2- بهینه سازی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز42
6-2- الكتروفورز فراورده های PCR43
1-6-2- الكتروفورز افقی در ژل آگارز43
2-6-2- الكتروفورز عمودی در ژل پلی آکریل آمید43
1-2-6-2- تیمار شیشه‌ها44
2-2-6-2- تزریق ژل44
3-2-6-2- گرم نمودن ژل45
4-2-6-2- واسرشته سازی محصولات PCR45
3-6-2 رنگ آمیزی ژل46
7-2- تجزیه و تحلیل داده ها47
1-7-2- امتیازدهی باندها47
2-7-2- تجزیه خوشه ای48
3-7-2-تعیین اندازه باندها و الگوی نواربندی اختصاصی48
فصل سومنتیجه گیری و بحث49
1-3- نتایج استخراج DNA50
2-3- بهینه سازی دمای اتصال آغازگرها52
3-3- بهینه سازی روش PCR52
4-3- بررسی نهایی نتایج حاصل از PCR52
5-3- بررسی چند شکلی های SSR54
6-3- بررسی و تحلیل روابط خویشاوندی بین ارقام57
7-3- تعیین شناسنامه ژنتیکی برای ارقام60
7-3- تعیین شناسنامه ژنتیکی برای ارقام61
1-7-3- تعیین آللهای اختصاصی61
2-7-3- الگوی نواربندی اختصاصی در ارقام61
8-3- بررسی میزان خویشاوندی بین پایه ها64
9-3- تعیین شناسنامه ژنتیکی برای پایه ها65
1-9-3- تعیین آللهای اختصاصی65
فصل چهارم:نتیجه گیری کلی و پیشنهادات75
نتیجه گیری کلی80
پیشنهادات84
ضمائم87
منابع و مآخذ:90
دانلود طرح توجیهی مدرسـه غير انتـفاعي